Lebendzell‐Identifizierung von Inhibitoren des Lipid‐Transfer Proteins CERT Mithilfe von Nanoluciferase Bioluminescence Resonance Energy Transfer (NanoBRET)

Abstract

Abstract Es wird ein BRET‐System beschrieben, für das Nanoluciferase mit dem Lipidtransferprotein CERT fusioniert wurde. Dadurch wird ein effizienter Energietransfer auf ein mit Nilrot markiertes Ceramid ermöglicht, das entweder direkt an CERT gebunden oder zur benachbarten Golgi‐Membran transportiert wird. Der CERT‐vermittelte Transfer des Intermediats Ceramid ist Voraussetzung für die Bildung von Sphingomyelin, einer wichtigen Plasmamembrankomponente bei Säugetieren. CERT gilt als vielversprechende Zielstruktur für Medikamente, jedoch gibt es keine direkten zellbasierten Methoden zur effizienten Identifizierung von Inhibitoren. Der Nutzen der hier entwickelten Methode wurde anhand einer Bibliothek von 140 Derivaten des CERT‐Inhibitors HPA‐12 demonstriert. Diese wurden in einer kombinatorischen Synthese mittels Festphasen‐Transacylierung gewonnen. Das Screening der Bibliothek führte zur Identifizierung von sechs Verbindungen, die in einer Dosis‐Wirkungs‐Studie sowie in einer orthogonalen Lipidomics‐Analyse als dem HPA‐12 überlegen bestätigt wurden.